Strategien zur Stabilisierung und Normalisierung des Urins begünstigen eine unvoreingenommene Analyse des EV-Gehalts im Urin

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 17663 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Urin ist eine ideale Quelle für nicht-invasive diagnostische Marker. Einige intrinsische und methodische Probleme behindern immer noch das volle Potenzial als Flüssigbiopsiesubstrat. Im Gegensatz zu Blut variiert die Urinkonzentration je nach Ernährung, Flüssigkeitszufuhr und Umweltfaktoren. Urin ist mit EVs aus dem Harn-Genitaltrakt angereichert, während seine Konservierung, Reinigung und Normalisierung zu Verzerrungen bei der Analyse von EV-Untergruppen in inter- und intraindividuellen Vergleichen führen kann. Die vorliegende Studie bewertete die Methoden, die solche Verzerrungen verringern, wie z. B. eine angemessene und praktikable Urinlagerung, eine optimale einstufige EV-Reinigungsmethode zur Gewinnung von Proteinen und RNAs aus kleinen Urinmengen und eine Normalisierungsmethode für die quantitative Analyse von Urin-EV-RNAs. Ultrazentrifugation, chemische Fällung und Immunaffinität wurden verwendet, um EVs aus dem Urin gesunder Spender zu isolieren, der bis zu 6 Monate lang gefroren oder bei Raumtemperatur gelagert wurde. Mehrere biochemische und EV-Parameter des Urins, einschließlich Partikelanzahl und Proteingehalt, wurden in den Urinproben verglichen. Zu diesem Zweck wurden eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und eine Proteinbewertung mittels BCA-, ELISA- und WB-Assays durchgeführt. Diese Messungen wurden mit der relativen Häufigkeit ausgewählter EV-mRNAs und miRNAs korreliert, die mittels RT-PCR bewertet wurden, und hinsichtlich der Fähigkeit, Variationen des EV-Gehalts in Längsurinproben widerzuspiegeln und zu korrigieren, eingestuft. Alle Reinigungsmethoden ermöglichten die Rückgewinnung und anschließende Analyse von EVs bereits aus 1 ml Urin. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Langzeitstabilität von EV-RNAs bei Urinlagerung bei Raumtemperatur sowie eine hervorragende Korrelation des EV-Gehalts im Urin mit einigen routinemäßig gemessenen biochemischen Merkmalen, wie Gesamtprotein und Albumin im Urin, jedoch nicht mit Kreatinin, das üblicherweise zur Urinnormalisierung verwendet wird. Eine vergleichende Auswertung von mRNA und miRNAs in EV-Isolaten ergab spezifische RNAs, insbesondere RNY4 und ein kleines miRNA-Panel, deren Spiegel die EV-Variation zwischen den Proben gut widerspiegelten und daher als mögliche postanalytische Normalisierer des EV-RNA-Gehalts nützlich waren. Wir beschreiben einige realistische Urinverarbeitungs- und -normalisierungslösungen für eine unvoreingenommene Auswertung von EV-Biomarker-Studien und routinemäßigen klinischen Probenahmen und Diagnosen, die den Input für die Gestaltung größerer Validierungsstudien liefern, bei denen Urin-EVs als Biomarker für bestimmte Zustände und Krankheiten eingesetzt werden.

Urin ist eine attraktive und zugängliche Quelle potenziell wertvoller diagnostischer Marker für eine Reihe klinischer Erkrankungen, vor allem solche, die den Urogenitaltrakt betreffen, wie Nierenerkrankungen oder -verletzungen sowie Urogenitalkrebs. Darüber hinaus haben Urinbiomarker Potenzial auch für nicht-urologische Pathologien gezeigt1,2 wie andere Krebsarten (z. B. Brust- oder Lungenkrebs), Stoffwechsel- und endokrine Störungen (z. B. Diabetes), entzündliche Erkrankungen (z. B. Arteriosklerose und Osteoarthritis) und sogar neurodegenerative oder neuropsychiatrische Erkrankungen Krankheiten. Die Verwendung von Urintests zur Diagnose von Krankheiten ist eine alte Praxis (z. B. der Nachweis von Glukose bei Diabetikern durch Verkostung oder Anlocken von Ameisen oder der Nachweis von Albumin als Indikator einer Nierenerkrankung durch einen „Schaumtest“) und ist nach wie vor ein grundlegender Bestandteil der investigativen Medizin im 20. und frühen 21. Jahrhundert3. Mit dem Aufkommen moderner Omics-Techniken wird eine Vielzahl von Urinbestandteilen entdeckt, deren quantitative und qualitative Veränderungen im klinischen Bereich diagnostischen und prädiktiven Wert haben dürften.

Paradoxerweise wird Urin als völlig nicht-invasive Quelle für Flüssigbiopsie-Biomarker, die in Längsrichtung zur Diagnose und Überwachung verwendet werden können, noch immer wenig erforscht. Dieses Paradoxon ist auf die besonderen Eigenschaften dieser Bioflüssigkeit und auf die methodischen Hürden zurückzuführen, die Biomarker-Kandidaten immer noch daran hindern, das quantitative Vorrecht der Validierung und Durchführung diagnostischer Tests zu erlangen.

Im Gegensatz zu Blut, dessen Zusammensetzung und Volumen streng reguliert sind, unterliegt Urin keinen homöostatischen Mechanismen. Urin ist eine einzigartige Bioflüssigkeit, deren pH-Wert, Osmolalität, Zusammensetzung und Konzentration dispergierter gelöster Stoffe variieren können, sogar innerhalb derselben Person und über Stunden oder Tage hinweg4. Die Urinproduktion beim erwachsenen Menschen schwankt innerhalb eines normalen Bereichs von 0,6–2,6 l. Diese enormen inter- und intraindividuellen Schwankungen der Wasserausscheidungen und der Urinkonzentration, die von Ernährung, Flüssigkeitszufuhr, Aktivität oder Umweltfaktoren abhängen, erschweren objektive Messungen, die für die Definition eines Biomarkers als solchen von entscheidender Bedeutung sind. Die zuverlässige Identifizierung und Bewertung von Urin-Biomarkern dürfte von robusten und spezifischen Plattformen profitieren, die eine bessere Definition des Ursprungs (in Bezug auf Gewebe- oder Krankheitsspezifität) von Biomarkern versprechen, sei es in der löslichen oder festen Urinphase. Der Buchstabe besteht aus Sedimenten (typischerweise abgestoßenen Zellen) und extrazellulären Vesikeln (EVs).

Elektrofahrzeuge sind vielversprechend als Träger zellspezifischer Merkmale, die seltene, aber informative Biomarkerarten (Proteine, Glykane, Nukleinsäuren, Lipide, Metaboliten) einkapseln und somit stabilisieren.5 Auf diese Weise fungieren sie als Echtzeit-Wächter physiologischer oder pathologischer Gewebeveränderungen. Frühe wissenschaftliche Fortschritte bei der Untersuchung des Potenzials von Urin-EV-Biomarkern konzentrierten sich hauptsächlich auf Urogenitalkrebs und haben später die Suche nach Urin-EV-Biomarkern für andere Pathologien des Urogenitaltrakts inspiriert6. Tatsächlich basiert das erste und einzige kommerzielle EV-basierte Diagnosekit, ein IntelliScore, der 2018 von Exosome Diagnostics entwickelt und auf den Markt gebracht wurde, auf der Bewertung eines definierten EV-mRNA-Panels in Urinproben. Der Nutzen dieses Tests für die Patientenstratifizierung in fortgeschrittenen vs. indolenten Prostatakrebs wurde in prospektiven multizentrischen Studien umfassend validiert7,8. und heute wendet dieselbe Forschergruppe ein ähnliches Konzept für die Entwicklung und Validierung eines neuen, auf EV-RNA im Urin basierenden, nichtinvasiven Tests zur Transplantatabstoßung an9. Für eine umfangreiche Liste von Biomarkern für EV-Kandidaten im Urin, die in den letzten Jahren für verschiedene Pathologien beschrieben wurden, wurde jedoch keine signifikante Validierung durchgeführt, und der Vergleich zwischen den Studien bleibt äußerst schwierig. Es besteht ein allgemeiner Konsens6 darüber, dass einige methodische Aspekte der EV-Trennung und -Analyse, einschließlich der präanalytischen Handhabung und Normalisierung der Ergebnisse, immer noch bestehen und optimiert und standardisiert werden müssen, um die Umsetzung wissenschaftlicher Erkenntnisse in die klinische Praxis zu fördern.

Während EVs allgegenwärtig im Urin vorkommen, ist ihre Konzentration im Vergleich zu häufiger sezernierten Proteinen wie Uromodulin gering. Tatsächlich wurde in proteomischen Studien festgestellt, dass Uromodulin das am häufigsten vorkommende Protein ist, das die EC-Präparate verunreinigt. Der Grad der Kontamination hing von den Probandenproben und der verwendeten EV-Reinigungsmethode ab. Obwohl die Uromodulin-Kontamination als technische Herausforderung für die Effizienz der Urin-EV-Extraktion angesehen wird, zeigte sie nicht die offensichtliche Verringerung der Bandenbildung anderer häufig vorkommender EV-Proteine ​​in der Shot-Gun-Proteomik und beeinträchtigte nicht die Analyse der RNA-Fracht von EV im Urin10.

Der EV-Gehalt im Urin wird möglicherweise von verschiedenen Geweben verursacht, wobei eine Anreicherung mit Vesikeln erwartet wird, die aus verschiedenen Abschnitten des Urogenitalwegs freigesetzt werden6. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass die EV-Heterogenität noch ausgeprägter ist als bisher angenommen. Die bioinformatische Analyse von Omics-Daten zeigt eine breite Darstellung von Molekülen in Urin-EVs aus dem gesamten Körper, ohne dass eine große Tendenz zu Nieren- oder Urinproteinen zu erwarten ist10. Es wurden verschiedene Isolationsprotokolle für die proteomische und transkriptomische Analyse von Urin-EV beschrieben, die wahrscheinlich unterschiedliche Subpopulationen von Vesikeln isolieren oder zumindest unterschiedliche Ausbeuten und Reinheiten ermöglichen, die jeweils für unterschiedliche klinische Fragestellungen geeignet sein können4,11. Wir haben uns auf Methoden konzentriert, die eine einstufige EV-Isolierung ermöglichen und für skalierbare Volumina geeignet sind, sodass die Verarbeitung und Analyse sowohl routinemäßig entnommener als auch biobankierter Urinproben möglich ist. Die Probenkonservierung und -verarbeitung wirkt sich auf die Erkennung von im Urin enthaltenen Analyten aus, einschließlich EV-Untergruppen, und der Normalisierungsansatz kann zu Verzerrungen bei inter- und intraindividuellen Vergleichen/Bevölkerungsvergleichen führen. Wir haben uns mit den Aufbewahrungsmethoden befasst, die in der normalen klinischen Praxis anwendbar sind, sowie mit der Erleichterung der Logistik des Probenaustauschs in multizentrischen Studien. Bisher wurden mehrere Methoden zur Normalisierung der Entdeckung von Biomarkern im Urin vorgeschlagen, darunter die Zeitnormalisierung, die Kreatinin- oder Proteinnormalisierung12,13,14,15. Da EVs durch die für alle Urinbestandteile typischen Konzentrationsschwankungen beeinflusst werden, wurde die Anwendbarkeit ähnlicher Methoden auf EV-Biomarker vorgeschlagen und oft ohne vergleichende Bewertung verschiedener Methoden oder Korrelation mit den unabhängigen EV-Parametern innerhalb derselben Studie übernommen. Eine Zeitnormalisierung, insbesondere die kumulative Urinsammlung über 24 Stunden, ist schwierig umzusetzen und würde Biobankproben ausschließen, die typischerweise Spoturin enthalten. Aus praktischer Sicht wird der Stichurin oder alternativ der erste/zweite Morgenurin bevorzugt, wie er üblicherweise im Rahmen der klinischen Konsultationen gesammelt wird. Kreatinin wird am häufigsten zur Kalibrierung von Urinmessungen verwendet, auch in Studien mit Urin-EVs16, seine Schwankungen sind jedoch nicht vollständig einfach auf Schwankungen der Urinkonzentration zurückzuführen. Aus diesem Grund kann die Normalisierung auf Kreatinin krankheitsbedingte quantitative Variationen verschleiern und Vergleiche zwischen Populationen oder sogar die Längsschnittüberwachung beeinträchtigen. Es wird eine allgemeinere und zuverlässigere Normalisierungsmethode benötigt, die für den Einsatz von EV-Markern geeignet ist.

In dieser Studie haben wir uns zunächst mit den Bedingungen für die Lagerung und den Versand von Urin sowie der Durchführbarkeit einer Reinigungsmethode befasst, die für geringe Volumina geeignet ist (typisch für Proben in Biobanken), die eine zuverlässige Rückgewinnung und ausreichende Mengen an EV-Markern gewährleisten. Im zweiten Teil der Studie untersuchten wir die Normalisierungsmethode, einschließlich EV-Zählungen und Kreatinin-/Proteinmessungen, die bisher häufig in veröffentlichten Studien zu Urin-EVs verwendet werden, und verglichen sie mit biochemischen Urinindikatoren sowie absoluten und relativen Werten spezifischer EVs Markierungen. Obwohl wir eine Pilotstudie beschreiben, die auf einer kleinen Menge von Urinproben von Probanden basiert, diente sie uns dazu, die Korrelation und Rangfolge verschiedener Urin- und EV-Parameter zu ermitteln, die in größeren Validierungsstudien berücksichtigt werden können, die in einer oder mehreren unabhängigen Kohorten durchgeführt werden in Kombination mit den spezifischen Zustandsbiomarkern. Die Spezifikation und Integration dieser grundlegenden Anforderungen wird letztendlich zu einem Fahrplan für die Validierung und Bereitstellung von Urin-EV-Biomarkern beitragen.

Im ersten Teil der Studie führten wir einen methodischen Vergleich durch, der zwei Lagertemperaturen (− 80 °C und RT) zu zwei Zeitpunkten (Monat und 6 Monate) und drei Methoden zur Urin-EV-Extraktion (differentielle Ultrazentrifugation (UC)) umfasste ), immunaffinitätsbasierter Pulldown (IP) oder chemische Fällung (CP). Wir verwendeten 3 Probandenspender (gesunde Spender, Kaukasier, männlich, 35–45 Jahre alt). Um die Auswirkungen zufälliger Betriebsfehler auf a zu verringern Aufgrund der geringen Probengröße haben wir unabhängig voneinander zwei Aliquots für jede Urinprobe verarbeitet. Auf diese Weise konnten wir (1) die Standardabweichung zwischen technischen Replikaten bewerten und (2) zusätzliche biologische Replikate für jede Probe und jeden verwendeten Test bewerten. NTA, BCA und Die Kreatininbestimmung erfolgte auch ohne reinen Urin (vor der EV-Reinigung). Alle diese Variablen wurden in einem umfassenden Design kombiniert, das auch parallele Tests mehrerer unabhängig gemessener biophysikalischer und biochemischer Urin-EV-Parameter umfasste. Auf diese Weise, obwohl nur mit 3 begonnen wurde Bei den Probandenspendern mussten wir eine konsistente Anzahl experimenteller Punkte analysieren (Pfad 1A im Schema unten).

Im zweiten Teil der Studie befassten wir uns mit dem Problem inter- und intra-(täglicher) Probenvariationen im EV-Gehalt, wobei wir nicht erwarten würden, dass sich der physiopathologische Status unserer gesunden Probanden drastisch verändert hat. Wir gingen von 2 Probandenproben aus, gesunden Spendern, 1 Frau (Kaukasier, 45 Jahre) und 1 Mann (Kaukasier, 43 Jahre), von denen jeweils drei Längsschnittproben gesammelt wurden. Für jede gesammelte Probe wurden 2 Urinaliquots unabhängig von UC als Protokoll verarbeitet, das es uns ermöglichte, eine große Anzahl von EV-Parametern zu bewerten und zu vergleichen, wie beschrieben (Pfad 1B im Schema unten). Reiner Urin wurde für NTA, BCA und die vollständige biochemische Urinanalyse verwendet.

Schematische Darstellung des in der Studie durchgeführten Arbeitsablaufs.

Der erste Morgenurin wurde von gesunden Freiwilligen (Kaukasier, im Alter von 43–45 Jahren, Einzelheiten siehe „Studiendesign“) in einem sterilen Behälter mit Schraubverschluss gesammelt und bis zur Verarbeitung (Teil B der Studie) oder Lagerung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur aufbewahrt (Teil A). Vor der weiteren Verarbeitung oder Lagerung wurde der Urin 15 Minuten lang bei RT bei 300 g zentrifugiert (Eppendorf, Centrifuge 5804 R), um einen groben Niederschlag (Zellen und Zelltrümmer) zu entfernen. Der Urin wird 1 oder 6 Monate lang entweder bei –80 °C gelagert oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit Urinkonservierungsmittel (Norgen Biotek Corp.) ergänzt. Beim Einfrieren werden Urinproben zunächst bei −20 °C eingefroren und kurz darauf bei −80 °C aufbewahrt. Dies entspricht der Kapazität der Urinsammelpraxis in Krankenhäusern. Nach dem Auftauen wurde es auf 37 °C erwärmt und vor der Analyse und/oder EV-Reinigung erneut bei 300 g geschleudert. Der reine Urin (vor der EV-Isolierung) wurde für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), die Proteingehaltsbewertung (BCA) und den ELISA sowie für umfassende biochemische Urinanalysen verwendet, die im klinischen Analyselabor des San Raffaele Hospital durchgeführt wurden.

Nach 1 oder 6 Monaten Lagerung und bei gefrorenen Proben schnellem Auftauen und kurzer Erwärmung auf 37 °C haben wir den Urin zunächst durch Zentrifugation bei 300 × g vorgereinigt, um Sedimente zu entfernen, und die Probe anschließend bei 12.000 × g zentrifugiert um das MV-Pellet zu entfernen. Der Überstand wurde dann drei Exosomen-Reinigungsprotokollen unterzogen, bei denen Ultrazentrifugation (UC), chemische Fällung (CP) und durch Immunobeads (IP) vermitteltes Pull-Down zum Einsatz kamen. Das anfängliche Urinvolumen betrug 4 ml für UC und 1 ml für IP und CP, während für den anschließenden Protokollvergleich die Probenmenge berücksichtigt wurde, die dem ursprünglichen 1 ml Urin entsprach. Für jede Urinprobe wurden zwei Aliquots unabhängig voneinander mit jeder Reinigungsmethode verarbeitet, um die Robustheit der verwendeten Methoden zu bewerten (siehe „Studiendesign“). Das Aufwärmen der Probe vor der Probenvorklärung machte den Urin klar und hielt reichlich Urinbestandteile wie Uromodulin in Lösung, wodurch der Verlust von EVs aufgrund eines Einschlusses in großen proteingelartigen Komplexen während der niedrigen Zentrifugationsschritte vermieden wurde. Mithilfe der Lackmuspapiermessung haben wir auch einen normalen bis leicht alkalischen pH-Wert der gebrauchten Urinproben (7,5–8) bestätigt1. Wir zogen dieses Verfahren anderen Schritten vor, von denen berichtet wurde, dass sie die Löslichkeit von Uromodulin verändern, wie z. B. DTT oder Detergensbehandlung3,4. Das Ultrazentrifugationsprotokoll wurde von Cheng et al.17 angepasst. Kurz gesagt, der Urin wurde aufeinanderfolgenden Zentrifugationsschritten unterzogen, bestehend aus einer 10-minütigen Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit bei 15.000 g zur Sammlung von Mikrovesikeln (MV) und anschließenden Ultrazentrifugations- und Waschschritten bei 110.000 g (Beckman Coulter, Optima L-90K Ultrazentrifuge, Festwinkel). Rotor) für 2 Stunden. Alle Zentrifugationsschritte werden bei RT (22 °C) durchgeführt. Das Waschen erfolgt in partikelfreiem 1×PBS (Gibco) und es wurden keine zusätzlichen Filterschritte angewendet, um Elektrofahrzeuge weiter auszuschließen oder nach Größe auszuwählen. Die EV-Wiederherstellung nach dem IP-Protokoll basierte auf der Verwendung kommerziell erhältlicher NH2-Latexkügelchen (400 nm) (HansaBioMed Life Sciences, Tallin, Estland), die mit Anti-CD9-Antikörpern beschichtet waren, und folgte den Anweisungen des Herstellers und zuvor veröffentlichten Protokollen18. Die Proben wurden mit 10 μl Perlen bei 4 °C auf einem Rotator inkubiert. Nach der EV-Bindung wurden die Perlen durch Top-Tischzentrifugation (5000 × g für 10 Minuten) gewonnen und dreimal mit PBS 0,05 % Tween-20 (PBST) gewaschen. Zur EV-Isolierung durch CP wurden die Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Exo-Prep-Fällungsreagenz (HansaBioMed OU, Tallin, Estland) behandelt. Kurz gesagt, nach Zugabe des Exo-Prep-Reagenzes (Volumenverhältnis 1:4) wurden die Proben 1 Stunde lang in Eis inkubiert. Das Exosomenpellet wurde durch 10-minütige Tischzentrifugation bei 7000 × g gewonnen und dreimal in PBS gewaschen.

Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) wurde mit einem NanoSight LM10-HS-Mikroskop (NanoSight, Ltd.) durchgeführt, das mit einem 405-nm-Laser ausgestattet war, unter Verwendung der eingebetteten NTA-Software v3.00. Die Proben wurden mit PBS verdünnt, um eine Arbeitskonzentration von 20–120 Nanopartikeln pro Bild und/oder 107–109 Nanopartikeln/ml zu erreichen. Für jede Probe wurden drei 30-s-Videos mit einer Bildrate von 30 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Während der Messungen wurde die Temperatur überwacht und aufgezeichnet. Die aufgenommenen Videos wurden mit der NTA-Software (Version 3.2) (Malvern Panalytical) analysiert, um die Konzentration und Größe der Nanopartikel mit dem relativen Standardfehler zu bestimmen. Für die Analyse wurden automatische Einstellungen für Unschärfe, minimale Spurlänge und minimale erwartete Partikelgröße verwendet. Vor der Analyse wurde die Kalibrierung des NanoSight-Systems unter Verwendung von Polystyrol-Latex-Mikrokügelchen mit einer Größe von 100, 200 nm und 400 nm (NanoSight, Ltd.) durchgeführt.

Messungen der Proteinkonzentration in allen analysierten Proben wurden mit dem Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Der EV-basierte Sandwich-ELISA-Assay (ExoTEST™; HansaBiomed Life Sciences) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Kurz gesagt, Mikrotiterplatten, die mit den primären Fängerantikörpern Anti-CD9 und Anti-CD63 beschichtet waren, wurden mit Standards und Proben über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mikroplattenvertiefungen wurden mit primären Detektionsantikörpern Anti-CD9-bio behandelt, gefolgt von einer Inkubation mit HRP-Streptavidin-konjugierten Sekundärantikörpern und TMB-Substratlösung. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte wurde Stopplösung (2 N H2SO4) gegeben. Der Assay wurde unter Verwendung einer Standardkurve kalibriert, die mit linearen Verdünnungen von aus menschlichem Urin gereinigten Exosomen (HBM-PEU; HansaBioMed Life Sciences) erstellt wurde, die als Standards in das ELISA-Kit eingebettet waren. Die optischen Dichten wurden mit einem Mikroplattenlesegerät Infinite-M1000 (TECAN) bestimmt, das auf 450 nm eingestellt war.

Der EV-Proteingehalt wurde durch den Bicinchoninsäure-Assay bestimmt. Gleiche Mengen an Proteinen wurden in Laemmly-Probenpuffer resuspendiert und über SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen zum Nachweis von CD9 und CD63 oder unter reduzierenden Bedingungen zum Nachweis von Alix und TSG101 aufgetrennt. Die Proteine ​​wurden auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, 1 Stunde lang mit 5 % fettfreiem Milchpulver in TBS-T (0,5 % Tween-20) und dann mit den folgenden Antikörpern inkubiert: Anti-CD9 (1:1000, HansaBiomed Life Sciences) , Anti-CD63 (1:20.000, BD Pharmingen), Anti-TSG101 (1:1000, Abcam, Ab83, 4A10), Anti-GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology). Sekundäre HRP-konjugierte Antikörper (Anti-Maus/Kaninchen-IgG HRP-linked Whole Antibody Donkey, GE Healthcare) wurden verwendet und immunreaktive Banden wurden mithilfe der Enhanced Chemilumineszenz (ECL) (Merck Millipore) sichtbar gemacht. Die Signalintensität auf dem Blot wurde durch densitometrische Analyse mit der ImageJ-Software (ImageJ gebündelt mit 64-Bit-Java 1.8.0_172, heruntergeladen von https://imagej.nih.gov/ij/) weiter analysiert und quantifiziert.

EV-assoziierte RNA wurde aus jedem gereinigten EV-Pellet mithilfe eines RNA-Isolierungskits gemäß dem Protokoll des Herstellers (HansaBiomed Life Sciences) isoliert. Die RNA-Konzentration war zu niedrig, um durch fluorometrische Messung (Qubit RNA HS-Assay, Thermo Fisher) zuverlässig gemessen zu werden. Um die Expression von EV-assoziierten RNAs zu bewerten, wurde eine Echtzeit-PCR in dreifacher Ausführung mit dem miScript II RT Kit Qiagen zur Erzeugung von cDNA durchgeführt, die anschließend als Vorlage für PCR-Assays auf der SYBR Green-Technologie unter Verwendung von QuantiTect Primer Assays (Qiagen) für β-Actin verwendet wurde und PSA-mRNA. Für die ENY4-Amplifikation wurden die folgenden Vorwärts- und Rückwärts-Primerpaarsequenzen (5′–3′) verwendet: GTCCGATGGTAGTGGGTTA und AAAGCCAGTAAATTTAGC. Zur Beurteilung der miRNA-Expression verwendeten wir miScript-Primer-Assays (Qiagen) für einzelne interessierende miRNAs oder das TaqMan® Array Human Micro-RNA A þ B Cards Set plus Megaplex Pre-Amp-Primer (Thermo Fisher) zur Identifizierung von miRNA-Signaturen. Alle PCR-Reaktionen wurden im CFX96TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) unter Verwendung von 96-Well-Reaktionsmikroplatten (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) durchgeführt und zur Berechnung mit CFX Manager SoftwareTM analysiert Schwellenzyklen (Ct). Um Variationen in der RNA-Expression zu erkennen, werden die Ergebnisse entweder (1) unter Verwendung einer vergleichenden Ct-Methode ausgedrückt. Insbesondere werden Ct-Werte in Mengen in einer linearen Skala umgewandelt (unter der Annahme einer Amplifikationseffizienz von 100 % für jede mRNA, (2(40−Ct)); oder (2) unter Verwendung der ΔCt- und/oder ΔΔCt-Methode, wobei RNA daraus extrahiert wird Als Referenzprobe dienen aus Prostatakrebs-LnCAP-Zellkulturen isolierte EVs. Diese Referenz-EV-Proben sind derzeit bei HansaBiomed Life Sciences erhältlich.

Die statistische Analyse wurde mithilfe online verfügbarer Software zur Datenanalyse (www.icalcu.com) durchgeführt. Kurz gesagt, wir haben gegebenenfalls einen einpaarigen ANOVA-Test für Gruppenvergleiche angewendet, gefolgt von einem Tukey- oder Bonferoni-Post-hoc-Test. Einzelheiten werden in den Legenden für jede Datenzahl angegeben.

Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Institutionellen Ethikkommission des San Raffaele-Krankenhauses genehmigt (Protokollcode URINEBIOMAR, Datum der Genehmigung 04.08.2016). Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Die Hauptursache für Variabilität bei der Entdeckung und Validierung von Biomarkern sind präanalytische Entscheidungen hinsichtlich der Probenentnahme, -lagerung und -verarbeitung. Die aktuellen Konsensprotokolle für Urin-EVs befürworten die Lagerung bei –80 °C, obwohl Einfrieren und Auftauen zu einem gewissen EV-Verlust oder Artefakten wie EV-Aggregation oder selektivem Verlust größerer EVs (MVs) führen kann2. In dieser Studie haben wir die Verwendung eines im Handel erhältlichen Konservierungsmittels getestet, das die Konservierung von Urin-RNA/microRNA/DNA und Proteinen für mehr als 2 Jahre bei Raumtemperatur (RT) verspricht. Wir haben uns auf kleine nanoskalige Vesikel (nsEVs) konzentriert, von denen berichtet wird, dass sie bemerkenswert resistent gegenüber Gefrier-Tau-Zyklen sind19,20. Diese sind wahrscheinlich mit Exosomen angereichert, enthalten aber möglicherweise einen Anteil an Vesikeln, die nicht aus multivesikulären Körpern stammen. Die Stabilitätsbewertung wurde an Proben von drei gesunden Spendern durchgeführt, wobei von jedem Spender zwei Probenaliquots unabhängig voneinander verarbeitet wurden und insgesamt sechs biologische Replikate aufwiesen.

Um die Stabilität der Konzentration exosomenähnlicher Partikel und des Gesamtproteingehalts zu vergleichen, haben wir die Partikelanzahl mittels NTA-Analyse in vorgereinigtem Urin sowie in rekonstituierten MV- und Exosomenpellets aus UC- und CP-Proben gemessen. Wir haben die gleichen Proben auch mit einem auf Immunobeads basierenden IP-Protokoll verarbeitet (wie im Abschnitt „Studiendesign“ im Abschnitt „Material und Methoden“ erläutert), aber mit Bead-gebundenen EVs sind keine Analysemethoden wie NTA oder Proteingehaltsmessung möglich. Aus diesem Grund werden in den in den Abbildungen dargestellten Experimenten In den Abbildungen 1 und 2 wurden nur UC und CP verglichen, während alle drei Methoden für die EV-miRNA-Extraktion und -Quantifizierung verwendet wurden (Abb. 3). Wie aufgrund unserer bisherigen Erfahrungen zu erwarten war, lieferte UC hohe EV-Erträge. Wir konnten auch einen signifikanten Nachweis von Partikeln in Exosomengröße (mittlere Größe um 100 nm) in rekonstituierten MV-Fraktionen schätzen, was die zuvor beobachtete Co-Pelletierung von ebenfalls nanoskaligen EVs mit größeren Vesikeln bei niedrigeren Zentrifugationsgeschwindigkeiten bestätigt. In Proben, die nach 6 Monaten analysiert wurden, scheinen die gesamte EV-Konzentration und -Größe durch die Lagerung nicht wesentlich beeinflusst zu werden, obwohl die Anzahl der gewonnenen Vesikel bei Raumtemperatur (RT) etwas geringer ist (Abb. 1A). Umgekehrt bleibt die EV-Konzentration in einmonatigen Proben bei RT besser erhalten als in gefrorenen Proben (Abb. 1B).

Zählung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel (EVs), die aus unter verschiedenen Bedingungen konserviertem Urin isoliert wurden. EVs wurden aus Urin von drei gesunden Freiwilligen durch Differential-Ultrazentrifugation (UC) und chemische Fällung (CP) gereinigt und entweder bei –80 °C (F) konserviert oder mit dem Konservierungsmittel bei Raumtemperatur (P) adjuviert. Mikrovesikel (MV) wurden in die Analyse einbezogen. In die Beurteilung werden Proben von drei gesunden Spendern und zwei unabhängig verarbeitete Aliquots von jedem Spender einbezogen. Die Analyse der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) zeigt die Partikelkonzentration und -größe als Mittelwert + Standardabweichung nach 6 Monaten (A) und 1 Monat (B) Lagerung. Die Datenanalyse erfolgt unter Verwendung eines nichtparametrischen Tests für den Mehrgruppenvergleich, nämlich der 1-WEGE-ANOVA, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test. Es wurden keine signifikanten Unterschiede (p-Werte < 0,05) beobachtet.

Quantitative Analyse des Proteingehalts von Elektrofahrzeugen. EVs wurden aus Urin von drei gesunden Freiwilligen und zwei unabhängig verarbeiteten Aliquots von jedem Spender gereinigt. Die Urine wurden entweder bei –80 °C (F) eingefroren oder mit dem Konservierungsmittel adjuviert und bei Raumtemperatur (P) gelagert. Nach ein- und sechsmonatiger Probenlagerung erfolgte die EV-Isolierung durch Differential-Ultrazentrifugation (UC) und chemische Fällung (CP). Die Abbildung zeigt den Gesamtproteingehalt, gemessen durch den BCA-Assay, und den Kreatiningehalt, der im Gesamturin und in Urin-Mikrovesikel-Pellets (MV) und EV-Isolaten eines einzelnen repräsentativen Spenders (A) bestimmt wurde. Für dieselben Spenderproben wurde der spezifische Gehalt an kanonischen EV-Proteinen durch Western Blot untersucht (C, nämlich CD63, CD9, Tsg101 und Alix). (C) Die CD63- und CD9-Expression wurde auch für alle analysierten Proben durch einen ELISA-Assay gemessen (BEVs hergestellt). aus LNCaP-Zell-konditioniertem Medium wurden als Standards für relative Vergleiche im ELISA-Assay verwendet. Ein nichtparametrischer Test für Mehrgruppenvergleiche (jeweils drei Replikate) 1-WAY ANOVA gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test wurde für die Analyse der ELISA-Daten verwendet; Alle p-Werte < 0,05 sind mit *, < 0,01 mit **, < 0,001 mit *** gekennzeichnet.

Quantifizierung des EV-miRNA-Gehalts. Die Gesamt-RNA wird aus EVs extrahiert, die aus gesunden, von Spendern gewonnenen Urinproben (N = 3) gereinigt und entweder bei Raumtemperatur konserviert (P) oder gefroren (F) gelagert wurden, unter Verwendung eines auf Ultrazentrifugation basierenden Protokolls (UC), chemischer Fällung (CP) oder Immuno -Fällung mit Anti-CD9-beschichteten Perlen (IP). Die RT-qPCR-Amplifikation wird von miRNAs durchgeführt, von denen beschrieben wird, dass sie in EVs enthalten sind, nämlich miR-16, miR-21, miR-210 und miR.451. Wir zeigen die durchschnittliche relative miRNA-Expression aus drei biologischen Replikaten. Die relative Expression wurde in Bezug auf eine Referenzprobe mit bekanntem und konstantem RNA-Input (EV-RNA aus LnCAP-Zellkultur) berechnet. In die Beurteilung werden Proben von drei gesunden Spendern und zwei unabhängig verarbeitete Aliquots von jedem Spender einbezogen. 1-Wege-ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test wurden verwendet, um die statistische Signifikanz der beobachteten Unterschiede zu bestimmen. * bedeutet p-Wert < 0,05, ** p-Wert < 0,01 und *** p-Wert < 0,001.

Die NTA-Messungen stimmten weitgehend mit der Bestimmung des Gesamtproteingehalts überein (Abb. 2A). Nach 6 Monaten wies UC-Pellet höhere Werte in gefrorenen Proben auf (2,8-facher Anstieg), wobei der Trend derselbe war, jedoch ausgeprägter im Vergleich zu den gleichen Proben, gemessen in NTA (1,3-fach). Der Gesamtproteingehalt im Urin schien durch unterschiedliche Lagerungsbedingungen nicht beeinflusst zu werden, während in gefrorenen Proben im Vergleich zu RT-Proben höhere Kreatininwerte gemessen wurden (1,6-fach). Nach kurzfristiger Lagerung war der Proteingehalt des Exosom-UC-Pellets in bei Raumtemperatur gelagerten Proben deutlich höher (1,5-fach), während der Kreatininspiegel im Urin eine entgegengesetzte Drift aufwies und im Vergleich zu gefrorenen Proben um das 1,8-fache sank. Die Kreatininschwankungen führten nicht zu signifikanten Ergebnissen, aber der gegenteilige Trend, der für Kreatinin in Bezug auf den EV-Proteingehalt beobachtet wurde, warf Fragen hinsichtlich der Eignung von Kreatinin als Kalibrator des EV-Proteingehalts im Urin auf. Daher wurde dieser Frage im zweiten Teil dieser Studie weiter nachgegangen. Beobachtete Daten zur Konservierung von EV-Proteinen insgesamt stützen die Verwendung der RT-Lagerung von Urinproben, insbesondere für die Lagerung von einem Monat.

Wir haben die Menge an anerkannten EV- und Exosomenmarkern durch gängige quantitative Tests wie ELISA und Western Blot weiter bewertet. Der Sandwich-ELISA-Assay zur Messung des Anteils kleiner Vesikel, die CD9 und CD63 (ko)exprimieren, zeigte eine Korrelation mit dem Gesamtproteingehalt und der Messung der Vesikelzahl (Abb. 2B und ergänzende Abb. 1). CD9 und CD63 sind mit Exosomen angereicherte Tetraspanine, von denen bekannt ist, dass sie gut auf Harnvesikeln exprimiert werden4,6,10,21. Die Signale waren in Proben, die sechs Monate lang eingefroren aufbewahrt wurden, höher (mehr als das Dreifache), während sie in den Proben, die einen Monat lang bei RT gelagert wurden, im Gegensatz dazu ausgeprägter waren (ca. das Zweifache). Die Western-Blot-Analyse von UC-Pellet aus denselben Proben ergab übereinstimmende Daten hinsichtlich des Gehalts an echten Exosomproteinen Alix und Tsg101 (Abb. 2C). Der gegensätzliche Trend für die Tetraspanine CD9 und CD63, der von WB in langfristig (6 Monate) konservierten Proben festgestellt wurde, erhöht die Möglichkeit einer Kontamination von Pellets mit Membranfragmenten und würde mit einer beeinträchtigten Integrität von Vesikeln und Oberflächenproteinen bei Langzeitlagerung bei RT im Einklang stehen .

Der EV-RNA-Gehalt ist einer der grundlegenden Indikatoren für die Integrität und Funktionalität von Vesikeln, da es sich bei RNAs sowohl um mutmaßliche Biomarker als auch um Effektoren für pleiotrope Funktionen handelt, die von Vesikeln in Gesundheit und Krankheit ausgeübt werden3,7,9. Wir haben die Stabilität des Gesamt-RNA-Gehalts von Vesikeln, die aus unterschiedlich gelagerten Urinproben pelletiert wurden, bewertet, mit besonderem Fokus auf eine am häufigsten in Elektrofahrzeugen vorkommende RNA-Kategorie, kleine ncRNAs. Wir haben versucht, das Qubit 2.0 Fluorimeter (Qubit Small RNA Kit) zusätzlich zu den Konzentrationsschätzungen des Bioanalysators zu verwenden, um die Konzentrationen der Gesamt-RNA in Urin-EV-Proben zu quantifizieren. Die RNA-Profile des Bioanalysators stimmten mit einer Häufigkeit kleiner RNAs (miRNA) von > 80 % in allen Proben überein, der RNA-Gehalt war jedoch zu niedrig, um genaue Qubit 2.0-Messungen zu ermöglichen, wobei einige Proben < 250 pg/μl enthielten. Letzteres war zu erwarten, da unsere Proben aus Urinmengen von nur 1 ml11 stammten. Daher konnten wir keine feste RNA-Menge verwenden, sondern haben uns entschieden, ein gleiches ursprüngliches Urinvolumen für Input-Normalisierungs- und Amplifikationsreaktionen zu verwenden. Eine solche Entscheidung steht im Einklang mit der gängigen Praxis bei der diagnostischen Probenahme22. MiRNAs gehören zu den Exosomen-Frachtmolekülen, die erhebliches Interesse geweckt haben und bereits frühzeitig auf potenzielles klinisches Interesse untersucht wurden. Es wurde beschrieben, dass verschiedene miRNAs mit Harnblasen bei gesunden oder kranken Probanden assoziiert sind6,12,23,24,25. Zum Zweck der Stabilitätsprüfung haben wir in dieser Studie zunächst mehrere miRNAs erfasst, die häufig in Elektrofahrzeugen exprimiert werden, auch im Urin23,25. Innerhalb eines Monats nach der Lagerung werden notorisch häufig vorkommende miRNAs wie miR-21, 16 und 210 erfolgreich aus exosomengroßen Vesikeln, die aus 1 ml Urin gereinigt wurden, amplifiziert (mit Ct-Werten zwischen 23 und 33) und zeigten eine hohe Stabilität in Proben, die bei aufbewahrt wurden RT (Abb. 3). Der Gehalt der analysierten miRNAs wurde als relative Expression im Vergleich zu einer Referenzprobe mit bekanntem und konstantem RNA-Input (EV-RNA aus LnCAP-Zellkultur) quantifiziert13,14. Wie erwartet war miR-451 nur in geringer Menge vorhanden, wurde aber dennoch in allen getesteten Proben nachgewiesen. Eine erhöhte Stabilität von EV-RNAs bei Lagerung bei RT wurde auch nach 6 Monaten bestätigt, insbesondere in UC-Proben. Alle drei verwendeten Methoden lieferten Material, das zuverlässig amplifiziert und quantifiziert werden kann, mit der niedrigsten miRNA-Expression aus IP-Proben. Dieses Ergebnis wurde durch eine anerkannte Tatsache vorweggenommen, dass die Immunaffinität für EV-Subpopulationen selektiert und dabei die Ausbeute gegen Spezifität und Reinheit tauscht. Eine interessante Ausnahme wird für miRNA 210 beobachtet, die in IP-Proben stark angereichert war (Abb. 3).

Bei verschiedenen verwendeten Isolierungsprotokollen wurde eine gewisse Inkohärenz in der Ausbeute und Stabilität zwischen verschiedenen RNA-Spezies beobachtet. Die miR-21- und 16-Spiegel stimmten eher mit unabhängig gemessenen Vesikelparametern überein (Vesikelzählung mittels NTA oder Proteinquantifizierung). Ein möglicher selektiver Verlust einiger Arten und einiger Vesikel-Untergruppen kann, wie zuvor berichtet, vom Isolationsprotokoll abhängen3,15. Bemerkenswert ist, dass der Vorteil der RT-Konservierung gegenüber dem Einfrieren von Urin insbesondere bei der Wiederherstellung von mRNAs nach 6-monatiger Lagerung (Abb. 4) sowie bei der Wiederherstellung des MV-RNA-Gehalts deutlich wurde. In dieser Studie haben wir zwei RNAs untersucht, über die häufig in Bioflüssigkeits-EVs (Beta-Actin) und in Urin-EVs (PSA) berichtet wird. Die für diese Experimente verwendeten Proben stammten von männlichen Spendern und PSA-mRNA-Merkmale als Indikator für aus der Prostata stammende Vesikel. Insgesamt können wir beobachten, dass die Aufbewahrung des Urins bei RT für die anschließende EV-RNA-Analyse sowohl nach Langzeit- als auch nach Kurzzeitlagerung eine gute Option ist. Während eine Langzeitlagerung bei RT keine praktikable Strategie für die Proteinanalyse ist, könnte die Umsetzung innerhalb eines kurzen Zeitraums (innerhalb eines Monats) eine ausgezeichnete Lösung sein, die die Stabilität, einfache Handhabung und den Versand von Urinproben für eine umfassende EV-Analyse begünstigt. Ein Nebenhinweis aus dem ersten Datensatz, der eine eingehendere Untersuchung erfordert, ist, dass sowohl die Lagerung als auch die Isolierungsmethode zu einer Verzerrung hinsichtlich des Verlusts oder der Wiederherstellung bestimmter EV-Populationen im Urin führen könnten.

Quantifizierung des EV-RNA- und MV-RNA/miRNA-Gehalts. Die Gesamt-RNA wird aus MV-Pellets und aus EVs extrahiert, die aus gesunden, von Spendern gewonnenen Urinproben (N = 3) gereinigt und entweder bei Raumtemperatur konserviert (P) oder gefroren (F) unter Verwendung eines auf Ultrazentrifugation basierenden Protokolls (UC) gelagert werden. chemische Fällung (CP) oder Immunpräzipitation mit Anti-CD9-beschichteten Perlen (IP). Die RT-qPCR-Amplifikation von mRNAs, von denen zuvor beschrieben wurde, dass sie in Urin-EVs enthalten sind, nämlich β-Actin und RNY-RNA, wurde wie in Material und Methoden beschrieben durchgeführt. Sowohl diese mRNAs als auch miRNAs (miR-16, miR-21, miR-210 und miR.451) wurden auch in MVs analysiert. In die Beurteilung werden Proben von drei gesunden Spendern und zwei unabhängig verarbeitete Aliquots von jedem Spender einbezogen. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz der beobachteten Unterschiede wurden eine Einweg-ANOVA und ein Bonferroni-Post-hoc-Test verwendet. * bedeutet p-Wert < 0,05, ** p-Wert < 0,01 und *** p-Wert < 0,001.

Im zweiten Teil der Studie haben wir uns mit mehreren Normalisierungsoptionen befasst, die die Quantifizierung und Interpretation von Unterschieden in der Häufigkeit von Exosomen/EV-Proteinen und RNAs im Kontext der intrinsischen Variabilität der Urinkonzentration und des Urin-EV ermöglichen würden. Um die beste Wahl zu treffen, die zu unserem Umfang passt und die Methode sowohl für die Forschung als auch für die klinische Praxis umsetzbar ist, haben wir die folgenden Prämissen berücksichtigt. Obwohl für quantitative Vergleiche eine 24-Stunden-Urinsammlung wünschenswert sein könnte, ist die Sammlung des ersten Morgenurins definitiv ein praktischeres und konventionelleres Verfahren, das eine höhere Patientencompliance gewährleistet. Darüber hinaus haben Studien zur Proteinurie gezeigt, dass diese Methode zur Gewinnung zufälliger Urinproben gültig ist und dass die Proteinausscheidungsrate gut mit der im 24-Stunden-Urin gefundenen Rate korreliert16. Eine weitere häufige präanalytische Wahl in der gängigen Diagnostik ist die Volumennormalisierung der Proben. Bei Bluttests ist aufgrund einer strengen homöostatischen Kontrolle das Testen und Vergleichen gleicher Probenmengen eine Standardoption. Im Urin führt dieser Ansatz zu Inkonsistenzen bei der Quantifizierung von EV-Markern. Wir haben zunächst die Exosomenkonzentration und den Gehalt anerkannter vesikulärer Marker in Längsschnittproben untersucht, um die zuverlässigen und messbaren EV-Parameter zu identifizieren, die zur Normalisierung verwendet werden können. Zu diesem Zweck haben wir eine kleine Anzahl von Probandenproben von zwei gesunden Spendern verwendet, einem Mann (Kaukasier, 43 Jahre) und einer Frau (Kaukasier, 45 Jahre), von denen die Urinproben an drei aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt wurden. Jede Probe wurde in zwei Aliquots aufgeteilt, die unabhängig voneinander verarbeitet wurden, wodurch sich die Anzahl der biologischen Replikate erhöhte und die Auswirkungen eines zufälligen Betriebsfehlers auf eine kleine Probengröße verringerten.

Wir haben zunächst die Konzentration von Partikeln in Exosomengröße sowie den Proteingehalt sowohl in reinen Urinproben als auch in durch Ultrazentrifugation hergestellten EV-Isolaten gemessen. Diese Isolierungsmethode wurde ausgewählt, da sie nach wie vor die wichtigste Methode in Urin-EV-Studien ist und unter den in dieser Studie vorgestellten Reinigungsmethoden die beste Ausbeute liefert. Darüber hinaus sollte UC konzeptionell keine Verzerrung gegenüber bestimmten EV-Subpopulationen hervorrufen, es sei denn, sie begünstigt die Wiederherstellung kleiner EVs, während erhaltene EV-Isolate mit verschiedenen Methoden analysiert werden können, einschließlich NTA, ELISA und Western Blot. NTA-Messungen ergaben erhebliche Schwankungen der Gesamt-EV-Zahl innerhalb und zwischen zwei gesunden Spendern (Abb. 5A). Überraschenderweise gab es keine Korrelation zwischen den EV-Zahlen im Gesamturin und in gereinigten UC-Pellets, während eine gute Übereinstimmung zwischen dem Proteingehalt des Gesamturins und dem der extrahierten Exosomenfraktionen (UC) beobachtet wurde (Abb. 5A, B und ergänzende Abb. 1). Die Analyse kanonischer EV-Marker mittels Western Blot bestätigt tägliche Schwankungen des EV-Proteingehalts, gemessen im konstanten Urinvolumen (Abb. 5C). Die Expression der echten exosomalen Marker Tsg101 und Alix korrelierte offenbar schlecht mit dem Gesamtproteingehalt oder der Vesikelzahl und unterschied sich im Muster von den Tetraspaninen CD9 und CD63. Um einzelne Proteinmuster besser beurteilen zu können, haben wir eine densitometrische Analyse der Gelbanden durchgeführt (ImageJ, Abb. 5C), bei der das CD9-Signal andere unabhängige quantitative Parameter von EV-Pellets (Anzahl und Gesamtproteingehalt der Vesikel) am besten widerspiegelt. Bemerkenswert ist, dass CD9 laut Densitometrie eine hervorragende Korrelation mit dem Tsg101-Muster aufweist, jedoch nicht mit dem Alix-Muster. Obwohl CD9 nicht ausschließlich auf Exosomen beschränkt ist, sondern auch in MV reichlich exprimiert wird (hier nicht gezeigt), ist bekannt, dass es in Vesikeln in Exosomengröße stark angereichert ist, sowohl in Bezug auf Elternzellen als auch auf andere Vesikel-Unterfamilien. Der Reiz von CD9 liegt in der Tatsache, dass es auf der Vesikeloberfläche angezeigt wird und somit für Isolierungsstrategien und, was für den Schwerpunkt dieser Studie wichtig ist, für die schnelle Vesikelquantifizierung genutzt werden kann. Wie in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt, ist die Korrelation zwischen dem EV-Proteingehalt und der in isolierten kleinen EVs gemessenen Partikelkonzentration angemessen, aber nicht perfekt (R = 0,781), während der EV-Proteingehalt besser mit den Partikelzahlen im ursprünglichen unverdünnten Produkt korreliert Urin (R = 0,817). In ähnlicher Weise stimmte auch der CD9-Gehalt besser mit der im ursprünglichen Reinurin gemessenen Partikelzahl (R = 0,860) überein als in EV-Pellets (R = 0,607), während er gut mit dem Proteingehalt isolierter EVs korrelierte (r = 0,931). . Insgesamt fanden wir unter allen unabhängigen Indikatoren des EV-Gehalts im Urin das beste Übereinstimmungsmuster zwischen dem Proteingehalt isolierter EV-Pellets, einschließlich CD9-Messung, und der Gesamtzahl exosomenartiger (kleiner EVs) Partikel im ursprünglichen reinen Urin. Daher haben wir Behalten Sie bei, dass diese beiden die attraktivsten EV-bezogenen Parameter sind, um ihren Gesamtinhalt widerzuspiegeln.

Vergleichende Analyse des EV-Gehalts in Längsurinproben. EVs (UC) und MVs wurden durch ein auf Differenzialzentrifugation basierendes Protokoll aus Urin von zwei gesunden Freiwilligen, einer Frau (gekennzeichnet als 1) und einem Mann (gekennzeichnet als 2), 45 und 43 Jahre alt, in drei aufeinanderfolgenden Schritten gereinigt Tage. Für jede Probe wurden zwei Urinaliquots unabhängig voneinander verarbeitet und die Ergebnisse als Durchschnittswerte + Standardabweichung dargestellt. Der Gesamtproteingehalt wurde in einem Gesamturin gemessen, MVs und EVs durch BCA-Assay (A), Partikelkonzentration durch NTA-Messung bestimmt (B) und EV-Proteine ​​durch Western Blot bestimmt (C). Die Signalintensität auf dem Blot wurde durch densitometrische Analyse mit der ImageJ-Software weiter analysiert und quantifiziert und rechts dargestellt.

Die beobachteten täglichen Schwankungen des EV-Gehalts werden wahrscheinlich durch harntreibende Wirkungen verursacht. Um sie auszugleichen, können die Proben entweder i) unter Verwendung eines Volumenkorrekturfaktors normalisiert werden, der auf einer Messung eines Parameters basiert, der die EV- oder zumindest die Urinkonzentration genau widerspiegelt, ohne selbst zusätzlich durch eine physiologische oder pathologische Variable verzerrt zu sein, oder durch ii) Verwendung eines optimalen internen Normalisierers für jede Kategorie von Markern, die für uns von Interesse sind. Die Messung der oben identifizierten EV-bezogenen Parameter kann in beiden Strategien verwendet werden. Sie können als präanalytische Volumenkorrekturmethode vor der anschließenden Analyse von Proteinen oder RNAs in den EV-Präparaten verwendet werden. Sie können auch in der zweiten Normalisierungsoption als interne „Housekeeping“-EV-Marker verwendet werden. Für die objektive Protein-Biomarker-Messung ist die Normalisierung auf CD9- oder Tsg101-Spiegel eine praktikable Option, deren Wahl auf methodischen Anforderungen basieren würde (z. B. ein ELISA bzw. Massenspektrometrie). Wir werden ihre Verwendung zur Normalisierung der RNA-Expressionsdaten im folgenden Kapitel weiter diskutieren (Abb. 9).

Um die erste Option zu untersuchen, haben wir neben EV-intrinsischen Faktoren auch einige häufige biochemische Parameter berücksichtigt, die im Rahmen einer Standardlaboranalyse direkt im Urin gemessen wurden (ergänzende Abbildungen 2 und 6). Wir haben Kreatinin einbezogen, da es häufig zur Anpassung von Urinanalyten, einschließlich EVs, verwendet wird, obwohl seine Genauigkeit für diesen Zweck lange diskutiert wurde. Um potenziell nützliche biochemische Indikatoren zu identifizieren, haben wir zunächst den Grad der Assoziation zwischen jedem biochemischen Parameter, der in den Längsschnittproben gemessen wurde, und den relativen Messungen einer Partikelanzahl und eines Proteingehalts der extrahierten Urin-EVs (UC) bewertet (Abb. 6). ).

Analyse biochemischer Urinparameter in Längsurinproben. Urinproben werden aus dem Urin von zwei gesunden Freiwilligen, einer Frau (gekennzeichnet mit 1) und einem Mann (gekennzeichnet mit 2), 45 und 43 Jahre alt, an drei aufeinanderfolgenden Tagen entnommen. Diese Längsschnitturinproben wurden innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme einer routinemäßigen biochemischen Urinanalyse in einem klinischen Labor des San Raffaele Hospital unterzogen. Die Felder auf der rechten Seite zeigen die Korrelationsanalyse, die durch Auftragen der Werte ausgewählter biochemischer Parameter gegen die unabhängig in denselben Urinproben gemessenen EV-Parameter durchgeführt wurde. Erklärung der verwendeten Akronyme: CRJ2U, Kreatinin; ALBU2, Albumin; GLUC3, Glucose; TPU, Gesamtprotein im Urin; LH2, leichte Immunglobulinketten.

Von allen in Originalurinproben gemessenen biochemischen Parametern korrelierten der Gesamtproteingehalt im Urin (TPU) und der Albuminspiegel im Urin am besten mit dem geringen EV-Gehalt. TPU und Albumin korrelierten gut mit der Gesamtpartikelzahl im Urin (R = 0,875/0,961), mit dem Exosomenproteingehalt des Urins (R = 0,980/0,907) und mit dem CD9-Gehalt (R = 0,937/0,922) im Vergleich zur Kreatininkorrelation, die Koeffizienten von ergab 0,670, 0,843 bzw. 0,869. Weitere biochemische Parameter, deren Zusammenhang mit dem EV-Gehalt in Betracht gezogen werden sollte, sind die Glukosekonzentration im Urin und die Werte der schweren Immunglobulinkette (ergänzende Abbildung 1).

Beobachtete Korrelationen eröffneten eine interessante Möglichkeit, solche routinemäßig gemessenen biochemischen Urinanalyten zu verwenden, um diuretische Verdünnungseffekte zu kompensieren und den Gesamt-EV-Gehalt im Urin zu korrigieren/normalisieren (Abb. 7). Wir haben diejenigen Korrekturparameter als die vielversprechendsten erachtet, die die Variation zwischen verglichenen Längsschnitt-Urinproben am meisten verringerten. Der Variationskoeffizient (CV) wurde durch Division der relativen Standardabweichung und des Durchschnitts aller Proben berechnet. Beispielsweise verringerte die Korrektur der TPU-Werte im Urin tatsächlich den Variationskoeffizienten zwischen den Proben sowohl hinsichtlich der Anzahl der Urinpartikel als auch des Proteingehalts der Urin-Exosomen. Die Korrektur mit Urin-Kreatinin zeigte stattdessen einen schwachen Kompensationseffekt.

Normalisierung des EV-Gehalts auf biochemische Parameter des Urins. Die Parameter, die den EV-Gehalt im Urin in longitudinalen Urinproben am meisten aussagen, nämlich die Partikelkonzentration im gesamten Urin, der Proteingehalt und das in EV-Isolaten gemessene CD9-Signal, wurden mit biochemischen Urinparametern wie Gesamturinprotein (TPU) und Kreatinin (CRU) normalisiert ). Der Zweck dieser Normalisierung besteht darin, die Schwankung der EV-Konzentration zu verringern, die hier durch die Verringerung des Variationskoeffizienten (CV) angezeigt wird. An drei aufeinanderfolgenden Tagen werden Urinproben von zwei gesunden Freiwilligen entnommen, einer Frau (gekennzeichnet mit 1) und einem Mann (gekennzeichnet als 2), 45 und 43 Jahre alt. Die Probenpunkte werden auf der x-Achse angezeigt.

Gemäß herkömmlichen Ansätzen zur Ausarbeitung und Normalisierung von Genexpressionsdaten kann die Analyse des exosomalen RNA-Gehalts von einigen anerkannten internen Normalisierern profitieren, die die RNA-Spezies umfassen, die in verschiedenen menschlichen Geweben und Probentypen stabil exprimiert werden und Berichten zufolge auch in Vesikel sortiert werden , sind jedoch nicht vesikelspezifisch. Zu den Beispielen für Letzteres gehören β-Actin- oder GAPDH-mRNAs oder einige miRNA-Arten, einschließlich miR-16, miR-191 oder miR-243,15,25,26. In der Vergangenheit wurden häufig kleine nukleoläre RNAs (z. B. SNOU6) für die miRNA-Expressionsanalyse vorgeschlagen, während die neue Politik darin besteht, qPCR-Daten unter Verwendung derselben Klasse von Biomolekülen zu normalisieren.27,28 Um der Komplexität der Bioflüssigkeiten gerecht zu werden, ist dies der Fall Es wäre äußerst nützlich, die RNA-Spezies zu identifizieren und zu verwenden, die in interessierenden Vesikeln, in diesem Fall exosomenähnlichen Vesikeln, angereichert sind. Darüber hinaus könnte je nach Zweck der Studie die Verwendung von RNAs in Betracht gezogen werden, die sich für organspezifische Vesikel normalisieren können. Wir haben die Expression von drei verschiedenen mRNAs im Satz von Längsproben untersucht, die so ausgewählt wurden, dass sie verschiedene RNA-Kategorien repräsentieren, die für mögliche Normalisierungsstrategien relevant sind (Abb. 7). Bemerkenswert ist, dass mRNAs sowohl in EV- (UC-Pellets) als auch in MV-Fraktionen aller Proben vorhanden waren (Abb. 7), im Gegensatz zu einem Proteingehalt, der zu niedrig und daher in MV-Pellets nicht nachweisbar war (nicht gezeigt). Beta-Actin wurde als häufig verwendeter Genexpressionsnormalisierer ausgewählt. Das PSA-Transkript wurde als potenzielle prostataspezifische mRNA vorgeschlagen, die sowohl den Wert eines Normalisierers als auch die eines Krankheitsbiomarkers haben kann29,30. PSA-mRNA wurde häufig in Urin-EVs gemeldet und bewertet. Schließlich haben wir RNY4 eingesetzt, ein Mitglied der HY-RNA-Familie, das als häufig vorkommende RNA-Spezies in Bioflüssigkeiten und in EVs nachgewiesen wurde29,31,32.

Alle diese mRNAs wurden bei der RNA-Extraktion aus EVs in einem Material nachgewiesen, das 1 ml der Ausgangsurinprobe entspricht, wobei an allen experimentellen Punkten ungefähr ähnliche Trends beobachtet wurden (Abb. 8). Beta-Actin und insbesondere PSA-mRNA wurden in den analysierten Proben nicht reichlich exprimiert. Eine schlechte Expression der PSA-mRNA würde mit ihrem spezifischen Prostata-Ursprung und der Tatsache übereinstimmen, dass wir keine Isolierungsmethode verwendet haben, die eine spezifische Anreicherung von aus der Prostata stammenden Vesikeln ermöglicht. Überraschenderweise korrelierte die EV-Expression der PSA-mRNA jedoch nicht mit dem Geschlecht des Spenders. In einer weiblichen Spenderprobe wurde ein höheres Signal für PSA-mRNA erhalten (1,1–1,3), was Zweifel an der Nützlichkeit dieser mRNA als wirklich prostataspezifischen Marker aufkommen lässt. Stattdessen wurde RNY4 aus allen UC-Pellets gut amplifiziert. Wir haben zuvor bestätigt, dass diese kleine RNA in Bezug auf Elternzellen in exosomengroßen Vesikeln mehrfach angereichert ist (~ ΔCt = 10). Diese beiden Beobachtungen bilden die Voraussetzung dafür, dass es sich um eine vielversprechende interne Referenz für die EV-RNA-Analyse im Urin handelt.

Nachweis von Urin-EV-mRNAs durch RT-qPCR in Längsschnittproben. Nach der Ultrazentrifugation wurde die Gesamt-RNA aus EV- (UC) und MV-Pellets extrahiert und die RT-qPCR-Amplifikation der interessierenden mRNAs wie beschrieben durchgeführt. Die Reinigung erfolgt an drei aufeinanderfolgenden Tagen an Urin von zwei gesunden Freiwilligen, einer Frau (gekennzeichnet mit 1) und einem Mann (gekennzeichnet mit 2), 45 und 43 Jahre alt. Für jede Probe wurden zwei Urinaliquots unabhängig voneinander verarbeitet und die Ergebnisse als Durchschnittswerte + Standardabweichung dargestellt. Die Ergebnisse werden sowohl als Ct-Werte (links) als auch als relative RNA-Expression (rechts) angezeigt, berechnet als Delta-Ct gegenüber der Referenzprobe (RNA, extrahiert aus Exosomen der Prostatakrebs-LnCAP-Zelllinie).

Auf den ersten Blick spiegelte das absolute mRNA-Expressionsmuster (gemessene Zeilen-Ct-Werte) nicht die EV-Anzahl und Proteinkonzentration wider, die in denselben EV-Pellets gemessen wurden (Vergleich von Abb. 5 und Abb. 8). Andererseits zeigt die Umwandlung der Ct-Werte in Mengen (unter Verwendung der vergleichenden Ct-Methode) (Abb. 8C) oder die Umwandlung in eine lineare Skala (unter der Annahme einer Amplifikationseffizienz von 100 % für jede mRNA, (2(40−Ct))) die Muster, das perfekt mit dem insgesamt geringen EV-Gehalt im Urin korreliert (wie in Abb. 5 beobachtet). RNY4 wurde in allen Proben am häufigsten exprimiert und korrelierte mit der Gesamtpartikelzahl im Urin sowie mit dem Protein- und CD9-Gehalt in Urin-EVs mit entsprechenden Korrelationskoeffizienten von R = 0,987, R = 0,0777 und R = 0,837 (Abb. 8). Bemerkenswert ist, dass die relative RNY4-Expression gut mit dem Gesamtproteingehalt des Urins korrelierte, insbesondere mit dem Albumingehalt (R = 0,900), und nicht mit dem Kreatininspiegel (R = 0,585) (Abb. 9). Als wir versuchten, die Variationen der RNY4-Expression zwischen den Proben durch Normalisierung mit Kreatinin oder Urin-Gesamtproteinen zu korrigieren33, beobachteten wir keinen Rückgang des CV zwischen den Proben, während die beste Korrektur durch Berücksichtigung der jeweiligen CD9-Werte in der Probe erzielt wurde. Letzteres verringerte die Gesamtstreuung zwischen den Stichproben auf weniger als 10 % (Abb. 9). Dies unterstützt die Verwendung von CD9 als „Haushalts“-EV-Marker zur Korrektur urinverdünnungsbedingter Schwankungen des EV-RNA-Gehalts.

Normalisierung der Schwankungen des EV-RNA-Gehalts auf biochemische Parameter des Urins sowie der EV-Anzahl und des Proteingehalts. Die RV-RNY4-RNA-Expressionsniveaus in den longitudinalen Urinproben wurden zunächst gegen ausgewählte biochemische Urinparameter, nämlich Kreatinin, Albumin und Gesamtproteingehalt im Urin, sowie gegen unabhängige EV-Gehaltsindikatoren wie die im gesamten Urin gemessene Partikelzahl und CD9 aufgetragen Signal gemessen in den jeweiligen EV-Isolaten (links). Dieselben Parameter wurden anschließend bei dem Versuch verwendet, Variationen der EV-RNA-Signale in den Proben zu normalisieren/zu kompensieren, was sich in einer Abnahme des Variationskoeffizienten (CV, rechts) zeigte. EVs (UC) wurden durch ein auf Differenzialzentrifugation basierendes Protokoll aus Urin von zwei gesunden Freiwilligen, einer Frau (gekennzeichnet als 1) und einem Mann (gekennzeichnet als 2), 45 und 43 Jahre alt, an drei aufeinanderfolgenden Tagen gereinigt. Die experimentellen Punkte sind auf der x-Achse des rechten Panels angegeben. Die auf der relativen Y-Achse angezeigten Indikatoren stimmen zwischen dem linken und dem rechten Bereich überein.

Im letzten Teil unserer Studie haben wir versucht, unseren Ansatz zur Identifizierung der besten EV-Normalisierer zu hinterfragen, indem wir ihn auf ein kommerziell benutzerdefiniertes miRNA-Array angewendet haben. Wir haben das Array mit 24 miRNAs ausgewählt, darunter sowohl mutmaßliche Normalisierer für verschiedene Gewebe und Bioflüssigkeiten als auch mutmaßliche Marker für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, die wir bereits für die Analyse der EV-miRNA-Expression in Krebsplasmaproben eingesetzt haben (nicht veröffentlicht). ). Wir haben dieses Panel-miRNA-Expressionsmuster in unserem kleinen Längsschnittprobensatz bewertet und zwei Cluster identifiziert (Abb. 10). Der erste (Cluster 1) umfasst miRNAs, die notorisch und häufig in verschiedenen menschlichen Proben und Geweben exprimiert werden (z. B. miR-16, -21, -191, -24). Bei der Auswertung der Ct-Werte für die gleiche Urinmenge scheinen diese unabhängig von den zuvor beobachteten Schwankungen der EV-Konzentrationen in allen Proben einheitlich zum Ausdruck zu kommen. In einem Kontrollexperiment mit aus LnCAP-Kulturen stammenden EVs stellten wir fest, dass diese miRNAs in Bezug auf ein entsprechendes Elternzelllysat nicht an EVs angereichert waren (Abb. 10B). Umgekehrt umfassen die Spiegel einer zweiten Gruppe von miRNAs miR-223, -150, -145. -636 und RNU6 (Cluster 2) veränderten sich über die Längsschnittproben und scheinen in Bezug auf die jeweiligen Zellen an Kontrollstandard-EVs angereichert zu sein. Die relativen miRNA-Expressionsniveaus korrelierten besser mit den zwischen den Proben beobachteten Schwankungen der EV-Anzahl und des Proteingehalts, insbesondere für miRNAs, die zum zweiten Cluster gehören (Abb. 10A und C). Die beste Korrelation der EV-miRNA-Expression wurde in Bezug auf die Gesamtpartikelzahl im Originalurin festgestellt (R = 0,967–0,986 für mRNAs, die miR-150, -636, -145 und -223 umfassen, verglichen mit R = 0,368–0,795 für miRNAs wie z als miR-191, -21, -21, -16) und in Bezug auf CD9-Spiegel in extrahierten Urin-EVs (R = 0,821–0,904 für den ersten Cluster und R = 0,644–0,920 für den zweiten) (Abb. 10C). Dementsprechend war die relative Expression der miRNA-Cluster miR-150, -636, -145 und -223 (Cluster 2) gut mit dem Albuminspiegel im Urin (R = 0,886–0,943), jedoch nicht mit dem Kreatinin im Urin (R = 0,533–0,775) assoziiert ), im Gegensatz zum Cluster miR-191, -21. -21, -16-Expression (Cluster 1), die nur eine schwache Korrelation mit den biochemischen Urinparametern zeigte (R = 0,381–0,775 für Albumin und R = 0,568–0,746 für Kreatinin) (Abb. 10C).

Nachweis von EV-miRNAs im Urin mittels RT-qPCR in longitudinalen Urinproben. Nach der Ultrazentrifugation wurde die Gesamt-RNA aus EV- und MV-Pellets extrahiert und die RT-qPCR-Amplifikation und Quantifizierung eines 24-miRNA-Taqman-Custom-Arrays wie beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse werden sowohl als Ct-Werte (B) als auch als relative RNA-Expression (Tabelle A und Panel B rechts) ausgedrückt, berechnet als Delta-Ct gegenüber der Referenzprobe (RNA, extrahiert aus Exosomen der Prostatakrebs-LnCAP-Zelllinie). Der Korrelationsindex wurde zwischen dem beobachteten Trend der miRNA-Expressionsniveaus in den Proben und den jeweiligen Werten für ausgewählte EV-Parameter (Partikelkonzentration und Proteingehalt) sowie biochemischen Parametern, die in denselben Urinproben gemessen wurden (Kreatinin, Albumin und Gesamtproteingehalt), bestimmt ) (C). Schließlich wird versucht, die miRNA-Expressionsniveaus an Längspunkten zu normalisieren, indem die am besten korrelierenden EV- und Urinparameter verwendet werden (D). EVs (UC) wurden durch ein auf Differenzialzentrifugation basierendes Protokoll aus Urin von zwei gesunden Freiwilligen, einer Frau (gekennzeichnet als 1) und einem Mann (gekennzeichnet als 2), 45 und 43 Jahre alt, an drei aufeinanderfolgenden Tagen gereinigt. Experimentelle Punkte werden auf relativen x-Achsen angezeigt. Für jede Probe wurden zwei Urinaliquots unabhängig voneinander verarbeitet und gemittelt.

Letztendlich haben wir versucht, die Schwankungen der miRNA-Expression in EV-Präparaten zwischen den Proben zu kompensieren, indem wir die Ergebnisse anhand von EV-Parametern normalisierten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn die im reinen Urin gemessene Partikelzahl und der CD9-Gehalt im Urin verwendet wurden (Abb. 10D). ). Ein solches Ergebnis stimmte mit unseren zuvor beschriebenen Ergebnissen überein.

Insgesamt würde ein solcher Ansatz Cluster 2 als attraktives miRNA-Panel für die weitere Validierung als Kalibrator für den EV-miRNA-Gehalt im Urin in der erweiterten Probenkohorte hervorheben.

Wir wollten unseren Ansatz und unsere Ergebnisse mit einer weit verbreiteten und anerkannten Methode zur Identifizierung zuverlässiger interner Kontrollen zur Normalisierung von miRNA-/Genexpressionsdaten vergleichen. Diese Methode besteht in der Verwendung statistischer Algorithmen, die die Referenzgene einordnen, indem sie ihre Gesamtexpressionsstabilität in Verbindung mit anderen möglichen Kontrollgenen berechnen. Wir haben in der Tat drei der am häufigsten verwendeten und am häufigsten kombinierten Softwarelösungen, nämlich GeNorm, NormFinder und BestKeeper (ergänzende Abbildung 3A – C), auf die Eingabedaten angewendet, die entweder relative Ausdrucksdaten (Mengen) oder absolute Ausdrucksdaten (Ct-Werte) umfassen, die von uns gesammelt wurden Pilotbeispielsatz, entsprechend den Anforderungen jedes Algorithmus34. Die Grundannahme all dieser Algorithmen besteht darin, dass die untersuchten Kandidaten-Referenzgene in ihrer Expression in den betrachteten Proben nicht systematisch variieren. Auch wenn dies im Hinblick auf die Auswirkungen verschiedener physiologischer oder pathologischer Zustände zutrifft, wird diese Annahme im Szenario der Identifizierung und Implementierung von Harnvesikel-Biomarkern in der Praxis durch tägliche Schwankungen in der diuretischen Verdünnung des Urins verletzt. Wenn wir das in dieser Studie angewandte Szenario verfolgen, bei dem die gleichen Eingabevolumina der Proben verwendet werden, ohne die Eingabe von cDNA für die RT-PCR zu normalisieren, dann ist die Verwendung von Rechenalgorithmen von Natur aus fehlerhaft. Die Messung von RNA/cDNA, die aus EVs extrahiert wurde, die aus geringen ursprünglichen Urinmengen (1 ml) isoliert wurden, ist selbst bei Verwendung von Qubit-Assays schwierig und ungenau und für Routine- oder Hochdurchsatzanalysen zeitaufwändig und kostspielig. Tatsächlich würden alle drei Algorithmen, die zur Analyse von miRNA-Expressionsdaten in einem Pilotsatz von Längsschnittproben (6 Versuchspunkte, 12 unabhängig verarbeitete Proben) verwendet wurden, die stabilsten Gene miR-24 und miR-16 anzeigen, die offenbar in allen Proben stabil sind ohne von den tatsächlichen Unterschieden in der EV-Konzentration beeinflusst zu werden. Dieser Ansatz weist in diesem Fall eindeutige Einschränkungen bei der Auswahl zuverlässiger interner Referenzen auf, da der fehlende statistische Effekt die stichprobenspezifische Variation nicht berücksichtigt und somit das in dieser Studie angesprochene spezifische Problem nicht berücksichtigt wird.

Die vorliegende Studie befasst sich mit einigen grundlegenden, noch nicht gelösten Problemen bei der Analyse von Urin-EVs und damit verbundenen Inhalten, insbesondere RNAs, hinsichtlich der Verzerrung aufgrund präanalytischer Variablen und ungeeigneter Normalisierungsstrategien. Während die Lösung dieser Probleme der Forschung, der Biomarker-Entdeckung und der Diagnostikentwicklung Vorteile bringen würde, tendieren wir dazu, die Lösungen zu bevorzugen, die wahrscheinlich eine weitgehende Übereinstimmung mit den aktuellen klinischen Laborpraktiken in Bezug auf Zeitplanung und Verarbeitung von Urinproben bieten. Gleichzeitig werden auch die Protokolle angesprochen, die die Probenhandhabung für Lagerung und Transport erleichtern würden, um den Anforderungen von Biobanking und multizentrischen Studien gerecht zu werden. Aus diesem Grund konzentrierten wir uns in dieser Studie auf „zufällige“ Urinproben und nicht auf die Sammlung von 24-Stunden-Urin, da erstere in klinischen Konsultationen und im Biobanking gängige Praxis sind und vermutlich gut mit 24-Stunden-Urin hinsichtlich ihrer Proteinausscheidungsraten korrelieren16.

In der EV-Forschung werden die präanalytischen Unterschiede dadurch verschärft, dass das Gebiet relativ neu ist und immer noch eine Bindung an „laborspezifische“ Protokolle besteht und es insgesamt an Konsens mangelt. Dies betrifft insbesondere die multizentrischen Verbundstudien und die Verwendung biobankierter Proben zur Validierung von EV-Markern. Während intrinsische und extrinsische biologische Variationen zwischen Proben (z. B. Alter, Geschlecht, zirkadianer Rhythmus, Body-Mass-Index, Medikamente, aktuelle Krankheit usw.) bei der Interpretation der Daten sorgfältig berücksichtigt werden sollten, müssen technische Variationen, die während der Sammlung oder Verarbeitung auftreten, kontrolliert und kontrolliert werden hoffentlich ausgeschlossen. Die Stabilität einmal gereinigter kleiner Elektrofahrzeuge, einschließlich Exosomen, bei gefrorener Lagerung über längere Zeiträume ist bereits gut dokumentiert35. Allerdings kann die Lagerung von Urin nach der ersten Sammlung und vor der Exosomen-/EV-Isolierung und -Analyse in routinemäßigen klinischen Analyseumgebungen immer noch ein herausforderndes Problem darstellen, und noch mehr, wenn im Rahmen der Entdeckung großer Biomarker der Versand von Proben erforderlich ist Bemühungen. Um den Abbau zu verhindern und die Stabilität ansonsten instabiler Urinanalyten zu bewahren, sieht die übliche klinische Praxis vor, dass alle Urinproben, sofern sie nicht innerhalb von 2 Stunden analysiert werden, während der Sammlung gekühlt und bis zur erforderlichen Analyse gefroren aufbewahrt werden. Darüber hinaus werden selten verschiedene Konservierungsmittel und Stabilisatoren eingesetzt, darunter Säuren, Basen, Formaldehyd, Toluol, Biozide oder Proteininhibitoren36. Viele Studien und unsere Beobachtungen haben gezeigt, dass die Urinlagerung bei –20 °C, die der standardmäßigen kurzfristigen klinischen Probenlagerung entspricht, für die EV-Wiederherstellung am ungünstigsten erscheint, sowohl aufgrund einer hohen Abbaurate als auch des dabei gebildeten ausgeprägten Calciumphosphatniederschlags spezifische Temperatur2. Tatsächlich herrscht allgemeiner Konsens darüber, dass eine Lagerung bei −70 bis −80 °C optimal sein sollte. Tatsache ist, dass die Lagerung großer Mengen und der Versand gefrorener Proben zur EV-Analyse kostspielig und unzuverlässig sein und möglicherweise deren Stabilität beeinträchtigen kann. Das Einfrieren von Proben kann potenziell zum Verlust von EVs führen, entweder aufgrund einer verstärkten Aggregation von Vesikeln oder ihrer Adsorption an der Oberfläche des Sammelgefäßes. Der weitere Vorteil der Vermeidung des Einfrierens von Urin und anderen Bioflüssigkeiten besteht darin, dass größere Mikrovesikel erhalten bleiben, die normalerweise während Einfrier- und Auftauzyklen verloren gehen.

Wir berichten über die Stabilität von Urin-EVs und deren Inhalt bei Aufbewahrung bei RT nach 6 Monaten sowie über die Wiederherstellung und Analyse von EV-Markern aus 1 ml des ursprünglichen Urinvolumens. Die Wahl einer bestimmten EV-Isolierungstechnik hängt von der Art der nachgelagerten Verwendung ab. Wir verwendeten drei einstufige EV-Pulldown-Protokolle, die alle quantifizierbare EVs und zugehörige Marker wiederherstellten. Wir beobachteten Unterschiede in der Ausbeute und in den relativen Verhältnissen verschiedener gemessener EV-Parameter, was mit den Berichten aus anderen Studien übereinstimmt. Bei der Erkennung bereits mit EV-Markern assoziierter Marker in Patientenproben mit geringem Volumen ist es möglich, die Ausbeute (wie CP) oder die ausgewählte Anreicherung der interessierenden EVs (IA) zu priorisieren sowie einfache und zeitsparende Lösungen (angeboten von) zu wählen beide). Wir berücksichtigen, dass es abhängig von unterschiedlichen Isolationsprotokollen und aufgrund ihrer unterschiedlichen Auswirkungen auf verschiedene Vesikel-Subpopulationen im Urin zu einem selektiven Verlust einiger bestimmter Marker, wie z. B. einiger miRNA-Arten, kommen kann3,15. Es wurde über eine bevorzugte Sortierung verschiedener miRNAs nach bestimmten Vesikelpopulationen berichtet, die sich durch Größe oder Immunphänotyp unterscheiden26. In diesen Pilotbewertungen verwendeten wir ubiquitär exprimierte RNAs, die nicht auf Vesikel beschränkt sind, obwohl die Beweise eine robustere Gesamt-miRNA-Profilierung aus der vesikulären Fraktion des Urins als direkt aus dem gesamten Urin belegen25. Dies bedeutet, dass, obwohl EVs wahrscheinlich den Großteil der Urin-RNAs enthalten, die Analyse von hierbei verwendeten Präparaten wie UC- oder CP-Pellets, die auch mitgefällte Verunreinigungen enthalten, nicht nur den Intra-EV-Gehalt widerspiegelt. In diesem Zusammenhang deuten einige Studien darauf hin, dass die extravesikuläre RNA im Urin nicht zusammen mit präzipitierten EVs wiedergewonnen wird, was mit dem hohen Vorkommen von Ribonukleasen im Urin nach UC37 übereinstimmt.

In dieser Studie haben wir uns für UC entschieden, da es einen Ausgleich zwischen einer No-Bias-Subpopulation und einer spezifischen EV-Subpopulation bietet, wobei diese EV-Isolierungsmethode zur Quantifizierung einer Vielzahl gängiger EV-Indikatoren weit verbreitet ist. Abschließend befassten wir uns mit der Eignung verschiedener Normalisierungsstrategien, die in der präanalytischen oder analytischen Phase der quantitativen Analyse von EV-mRNAs und miRNAs angewendet werden. Eine solche Normalisierung stellt eine Herausforderung dar, sowohl aufgrund einer großen inter- und intra-spenderspezifischen Urin-Diuretika-Variation an den longitudinalen Entnahmepunkten als auch aufgrund der intrinsischen EV-Heterogenität. Präanalytische und inanalytische Normalisierungsentscheidungen können auch zur Erzeugung verzerrter Daten führen und die Erkennung seltener und relevanter EV-Biomarker verschleiern. Es ist klar, dass die Anforderungen für die Expressionsanalyse in Urin-EVs möglicherweise nicht den jeweiligen Empfehlungen für aus Gewebe und Zellen stammende RNAs entsprechen und sogar von denen für andere Bioflüssigkeits-EVs abweichen können.

Unserer Meinung nach wäre eine präanalytische Normalisierung auf der Grundlage der Verwendung eines der routinemäßig gemessenen biochemischen Urinparameter attraktiv, um Schwankungen der Urinkonzentration zu bewältigen, und würde eine angemessene Anpassung entweder der Probenvolumina oder der gemessenen Mengen ermöglichen. Der letztgenannte Modus würde der Art und Weise entsprechen, wie die klinische Diagnostik heute volumetrisch durchgeführt wird: Typischerweise werden bestimmte Volumina einer Bioflüssigkeitsprobe gemessen und die Ergebnisse mit Referenzwerten verglichen. Bisher haben viele Studien die Verwendung von Kreatinin für solche Zwecke vorgeschlagen oder in Frage gestellt. Tatsächlich sind Kreatininspiegel nicht nur auf einfache Schwankungen der Urinverdünnung zurückzuführen, sondern vielmehr auf die Nierenfunktion und können daher zu einer Verzerrung bei Vergleichen zwischen Populationen oder sogar bei Längsschnittvergleichen führen. Dies könnte insbesondere bei pathologischen Zuständen deutlich werden und bei Vergleichen mit gesunden Personen möglicherweise übersehen werden. Stattdessen haben wir andere Parameter wie den Gesamtproteingehalt im Urin oder Albumin vorgeschlagen, die im Gegensatz zu Kreatinin gut mit den unabhängigen Indikatoren der EV-Konzentration im Urin, nämlich der Partikelanzahl oder dem EV-Proteingehalt, korrelieren. Auch der Salz- oder Glukosegehalt sowie die wahrscheinlich zusammenhängende Leitfähigkeit und Schwerkraft des Urins, die neben Kreatinin die am häufigsten verwendeten Indikatoren für die Urinkonzentration sind, bedürfen einer weiteren Betrachtung. Allerdings können auch Proteinurie oder Albuminspiegel im Urin durch einen bestimmten pathologischen Zustand beeinflusst werden. Wir müssen bedenken, dass weder die von der NTA gemessenen exosomenähnlichen Partikel noch der Proteingehalt des UC-Pellets ausschließlich auf EVs aufgrund von Artefakten bzw. co-pelletierten Kontaminanten zurückzuführen sind. Ein solches Korrekturmanöver sollte an einer größeren Probenkohorte getestet und möglicherweise an zustandsspezifische EV-Biomarker gekoppelt werden. Wir haben eine explorative Studie durchgeführt, in der wir eine große Anzahl von Parametern in einem kleinen Satz von Proben von gesunden Spendern untersucht haben, und haben konsistente Variationen innerhalb und zwischen den Proben festgestellt, die uns dazu veranlasst haben, diejenigen herauszufiltern, die für die Normalisierung der EV-Konzentration am vielversprechendsten sind. Auf diese Weise wird dieser Ansatz, obwohl er offensichtlich attraktiv ist und mit der etablierten klinischen Standardpraxis übereinstimmt, für die Validierung in erweiterten und spezifischen Probenkohorten durchführbar sein und optimierte SOPs für die Aufbewahrung von Urinproben implementieren.

Der Einsatz interner Kontrollen, sogenannter „Housekeeping“-Gene, ist die anerkannteste Strategie zur analytischen Normalisierung der Genexpressionsanalyse. Wir zeigen jedoch, dass die Anwendung von Strategien, die für Gewebeproben entwickelt und häufig verwendet werden, bei der Identifizierung der richtigen Normalisierungspanels für die EV-RNA-Analyse in komplexen Bioflüssigkeiten irreführend sein kann. Dies gilt insbesondere für Urin, der im Gegensatz zu Blut hinsichtlich Volumen, Konzentration und pH-Wert-Schwankungen „nicht gepuffert“ ist. Daher betrachteten wir diejenigen miRNAs als die besten EV-miRNA-Normalisierer, deren längsschnittlich bewerteter Trend unabhängig gemessene EV-Konzentrationsänderungen in denselben Proben gut nachahmte. Wir haben ein potenzielles Normalisierungspanel identifiziert, das unterschiedlich häufig vorkommende miRNAs umfasst und daher für verschiedene interessierende Ziele geeignet ist. Wir betrachten dieses Panel nicht als universelle Lösung, sondern schlagen vielmehr einen solchen Ansatz zur Bewertung und Definition der Normalisierungspanels vor, die auf eine bestimmte Forschung oder klinische Frage zugeschnitten sind.

Es gibt einige Belege für das Modell der geringen Häufigkeit und Belegung der Sortierung von miRNAs in kleine EVs38. Dies bedeutet, dass nur eine Teilmenge der Zell-microRNAs in exosomenähnliche EVs verpackt wird und der Gehalt, ausgedrückt in Kopien pro Vesikel, Berichten zufolge selbst bei reichlich vorhandenen miRNAs wie miR 223 gering ist (viel weniger als 1). Andererseits hat sich gezeigt, dass die Sortierung bestimmter miRNAs in EVs spezifisch ist39, entweder abhängig von der EV-Quelle oder auf einige EV-Subpopulationen beschränkt26. Beispielsweise können miRNAs mit bestimmten Tetraspaninen kosortieren. Dies würde gut zu der beobachteten starken Korrelation mit dem miRNA-Gehalt und der CD9-Expression in Urin-EVs passen und einige Implikationen für die Entwicklung von EV-Isolierungsstrategien liefern, die auf die spezifische Anreicherung bestimmter EV-Subpopulationen und bestimmter EV-Biomarker abzielen.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass RNY4 ein guter Kandidat als Teil eines internen Referenzpanels für die Analyse von EV-RNAs im Urin ist. Diese RNA wird von der RNA-Polymerase III transkribiert, während proteinkodierende Gene von der RNA-Polymerase II transkribiert werden. Allerdings weist das RNA-Pol-III-Transkriptom eine signifikante Sequenzkomplementarität zu proteinkodierenden Genen auf und es wird vermutet, dass es deren Metabolismus und Expression zusammenspielt und reguliert40. Diese kleine RNA könnte eine ausreichende Kontrolle für die Beurteilung der mRNA-Expression sein und weitere Bestätigungsstudien rechtfertigen. Ein Aspekt, der für jeden in Frage kommenden Normalisierer empirisch ermittelt werden muss, ist die eventuelle pathologische Variation. Beispielsweise wird berichtet, dass HY-RNAs bei einigen Krebsarten oder entzündlichen Erkrankungen mehrfach hochreguliert sind41. Es gibt auch Hinweise darauf, dass ein Teil der Verarbeitung der HY-RNAs in denselben Elektrofahrzeugen stattfindet, die sie transportieren42.

Es ist bemerkenswert, dass der EV-Gehalt von CD9 eine gute Option für immunometrische Messungen ist, die leicht in die Analyse anderer EV-Marker (nicht nur Proteine) im Urin integriert werden können, während Tsg101 ein attraktiver Kandidat für die Probennormalisierung in der Phase der Biomarker-Entdeckung bleibt Massenspektrometrie und metabolomische Studien. Die Stabilität der Expression dieser exosomalen Marker in den Proben könnte bei bestimmten pathologischen Zuständen wie Krebs und Entzündungszuständen in Frage gestellt werden und sollte daher im Rahmen spezifischer Biomarkerstudien sorgfältig berücksichtigt werden. Aufgrund einer Heterogenität der EV-Biogenesepfade und Immunphänotypen sollte außerdem die Co-Sortierung eines bestimmten Markers, der für CD9- oder TSG101-positive Vesikel von Interesse ist, ermittelt werden.

Körperflüssigkeiten sind eine unerschöpfliche Quelle von Biomarkern, die für die Diagnose und Prognose zahlreicher Krankheiten, einschließlich Krebs, nützlich sind. Insbesondere Urin gewährleistet aufgrund seiner einfachen Entnahme, seines weniger komplexen Inhalts im Vergleich zum Blut und der weitgehenden Widerspiegelung des Beitrags der Harnwege die Patientencompliance und die Langzeitüberwachung der Erkrankung. Andererseits erschweren die Schwankungen des Diuretikums und die zahlreichen Faktoren, die dessen Menge und Gehalt beeinflussen können, die Interpretation der Ergebnisse der Urinanalyse. Aus diesem Grund sind die präanalytischen und postanalytischen Entscheidungen hinsichtlich der Verarbeitung und Normalisierung des Uringehalts ein wichtiger Schritt bei der Identifizierung und Umsetzung von Biomarkern in die klinische Praxis. Da Elektrofahrzeuge als Ersatz für die Zellen, die sie produzieren, und als Echtzeit-Wächter der Gewebehomöostase gelten, hängt die volle Ausschöpfung ihres Biomarkerpotenzials entscheidend von einem korrekten Verständnis und einer Lösung dieser Probleme ab.

Insgesamt führt unsere Studie zu präanalytischen und analytischen Strategien, die den etablierten klinischen Verfahren am besten entsprechen, ohne dass eine umfangreiche Probenhandhabung und eine aufwändige EV-Reinigung oder -Zählung vor der Analyse erforderlich sind. Dieses explorative Studiendesign (unabhängige Probenverarbeitung für biologische Replikate und Bewertung einer großen Anzahl von Parametern in einem kleinen Probanden-Probensatz) ermöglichte eine Pilotbewertung von Längsschwankungen biochemischer und EV-Parameter im Urin und lieferte Kandidaten für die Validierung spezifischer Urin-EV-Biomarker Studien (geringe Anzahl von Parametern in großen Stichprobenkohorten).

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Forschungsartikels stützen, sind im Manuskript enthalten.

Extrazelluläre Vesikel

Nanopartikel-Tracking-Analyse

Mikrovesikel

Zimmertemperatur

Ultrazentrifugation

Immunaffinitätsbasierter Pulldown

Chemische Fällung

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Diese Arbeit wurde von der Regione Lombardia & Fondazione Cariplo (HYDROGEX-Projekt, Zuschuss Nr. 2018-1720) und vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union (MARVEL-Projekt, Zuschuss Nr. 951768) für RV und NZ unterstützt.

Urologisches Forschungsinstitut, Abteilung für experimentelle Onkologie, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Mailand, Italien

Riccardo Vago

Vita-Salute Universität San Raffaele, 20132, Mailand, Italien

Riccardo Vago

Exosomics SpA, 53100, Siena, Italien

Giorgia Radano, Davide Zocco und Natasa Zarovni

HansaBiomed Life Sciences OU, Tallinn, Estland

Natasa Zarovni

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Konzeptualisierung, RV und NZ; Probenverarbeitung und Methodik, RV, GRDZ und NZ; Datenanalyse, RV, DZ und NZ; Vorbereitung des Schreibens und des Originalentwurfs, Neuseeland; Schreiben, Rezension und Bearbeitung, RV und NZ; Aufsicht, RV und NZ Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt; Finanzierungsakquise RV und NZ

Korrespondenz mit Riccardo Vago oder Natasa Zarovni.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vago, R., Radano, G., Zocco, D. et al. Strategien zur Stabilisierung und Normalisierung des Urins begünstigen eine unvoreingenommene Analyse des EV-Gehalts im Urin. Sci Rep 12, 17663 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22577-3

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Eingegangen: 25. Februar 2022

Angenommen: 17. Oktober 2022

Veröffentlicht: 21. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22577-3

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